商业化规模的慢病毒载体生产：流言终结了吗？
本文节选自“Commercial-scale lentiviral vector manufacturing: is the myth busted?”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
使用慢病毒载体 (LV) 可以转导分裂和非分裂细胞，实现长期的、可能终生的转基因表达。与其它逆转录病毒载体相比，慢病毒被认为是相对安全的基因治疗工具，在过去10 年中，它们在临床试验中的使用率从2.9% （2012 年）增加了两倍多到 10.1%（2021年）。在三种FDA批准上市的、针对各种类型血液肿瘤的先进治疗药物产品中 - Kymriah™、Breyanzi® 和Abecma® - 慢病毒被用于体外修饰 T 细胞，以表达嵌合抗原受体。此外，其它体外使用的基于慢病毒的产品 Skysona™ 和 Zynteglo™ 已分别在欧洲市场上被接受用于治疗脑性肾上腺脑白质营养不良和β-地中海贫血。在临床试验中，慢病毒已成功用于治疗许多其它遗传疾病，最近，还有研究开始开发基于慢病毒的Covid-19 疫苗。然而，市场上仍然缺少应用于体内的慢病毒产品。尽管体内应用的慢病毒产品尚未商业化，但它们正在管线开发中。
尽管体外应用需要相对较少量的慢病毒，但每位患者的治疗价格仍可能非常高，例如Kymriah为 47.5 万美元，Zynteglo 则高达180 万美元。很难想象体内使用的慢病毒基因治疗产品的价格会是什么样子？当然，在定义产品价格时，除了生产成本（设备、设施、耗材和起始/原材料）外，还需要考虑人工成本、市场分析等。然而，基因治疗产品价格高的主要原因之一是生产，换句话说，每批生产的病毒越多，价格可能越低。
长期以来，商业规模生产一直是病毒载体产品的瓶颈。在常用的贴壁2D 培养系统中，细胞只能生长到相对较低的细胞密度，因为在较高密度下细胞往往会脱落。在生物反应器中，可以实现更高的细胞密度，尤其是在应用灌流的情况下，但这样会增加总培养基消耗，并且在贴壁生物反应器的情况下，通常会有更高的胎牛血清(FBS)需要。用 FBS 补充培养基不仅会增加成本，而且它的使用还会导致安全和监管方面的问题，此外，由于许多基因治疗试验进入后期阶段，产品被接受进行商业化生产，其未来的可用性不确定。目前已有一些化学成分明确的无动物源性贴壁细胞培养基和FBS 替代品，例如 Pro293™a(Lonza)、OptiPEAK(Invitria) 和 PeproGrow-1(PeproTech)，然而，细胞适应新的培养基成分可能并不容易，需要进一步的培养基定制。
生产中最大的挑战与需要质粒转染的载体有关，例如腺相关病毒载体(AAV) 和慢病毒。使用传统的CaPO4 共沉淀方法相对便宜，但也是非常敏感的方法。它需要 FBS 的存在来降低细胞毒性作用，并且难以规模放大。对于大规模病毒制备，需要大量昂贵的高质量质粒。用于大规模生产的此类质粒的成本很容易超过每批10 万美元。另一方面，收获产物中的质粒DNA 对下游工艺来说是一个不小的挑战，因为在终产品中，它被认为是一个安全问题。幸运的是，市场上有很好的用于去除残留DNA 的核酸内切酶选择，例如 Benzonase®(Merck)、Denarase®(c-Lecta) 以及 M-SAN 和 SAN-HQ (ArcticZymes)。然而，如果没有工艺优化，它们的每批次价格也可能非常高。
在 2D 培养中，通常仅通过收集上清液来进行收获，而下游工艺通常包括通过超速离心来澄清和浓缩病毒。这对于小规模临床前实验可能已经足够了，但对于临床试验和商业生产来说还不够。
使用贴壁细胞进行慢病毒生产
在许多用于规模放大慢病毒生产的方法中，有多种2D培养系统被使用，例如 CellFactories™、HYPERFlasks® 和 HYPERStacks® 。然而，这些系统只能适度地提高生产力，操作费力，且培养条件不能完全控制，并且需要较大的培养箱空间。康宁的CellCube® 系统提供了更大的培养面积（一个 100 层模块可提供 8.5 m2的面积；表 1），可以将多个模块相互连接并进行灌流，从而更好地支持营养物质和氧气的供应。然而，它们也需要放置在培养器中。为了更好地控制培养条件，需要使用生物反应器。
世界上第一个基因治疗产品 Gendicine™ 是使用附着在 Fibra-Cel® 上的细胞生产的（表 1），换句话说，就是将微载体装填进悬浮生物反应器中。慢病毒也已经在这样的系统中进行了生产。尽管通过使用微载体可以大大增加培养面积（如果与最大的悬浮生物反应器一起使用），但存在结块和细胞脱落的问题，并且在下游工艺之前将病毒与微载体（以及细胞）分离可能很困难。
表1. 用于不同生产规模的贴壁和悬浮培养系统选择
中空纤维和固定床生物反应器（表 1）提供了一种更容易将病毒与细胞分离的解决方案。在 Quantum® 生物反应器 (Terumo BCT) 中，细胞附着在中空纤维上，而不是自由浮动的微载体上。遗憾的是，这个特殊的生物反应器的培养面积并不大，只有2.1 m2。相反，固定床生物反应器更具可放大性，且市场上已有多种选择。
Pall的一次性iCELLis® 固定床生物反应器包含数百个 13.9 cm2 非编织聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 纤维（“载体”），可提供0.53–4 m2 的 3D 细胞培养区域，适用于工艺优化和小规模生产，该系列提供最高可达 500 m2 的商业化规模生物反应器（66-500 m2），如果应用灌流（或再循环），收获体积可以达到数百升。iCELLis生物反应器有低压实（96 g/L）和高压实（144 g/L）两种选择，我们和其他团队已将它们用于生产许多不同的病毒载体、疫苗和重组蛋白。为了证明可放大性，我们在iCELLis Nano 生物反应器中优化了慢病毒的生产，例如接种细胞密度、灌流、转染和收获，并使用具有 333 m2 培养面积的商业化规模iCELLis 500 生物反应器成功进行了放大运行，换句话说，这是目前可用的最大低压实度固定床。
对于体外基因治疗，iCELLis Nano 的规模可能还不够，但 iCELLis 500 的大规模生产可能又太多了，至少对于临床试验而言是这样。遗憾的是，目前iCELLis 系列中缺少可能更适合体外治疗的中等规模生物反应器。几年前，Univercells在市场上推出了竞争性固定床生物反应器系列scale-X™，其提供小规模（2.4 m2，scale-X Hydro)、中等规模（10m2 和 30 m2，scale-X Carbo）以及大规模（200–600m2，scale-X Nitro)选项。scale-X 生物反应器背后的设计师就是最初开发 iCELLis 生物反应器的设计师。在 iCELLis 生物反应器中，固定床由数百个装在生物反应器内的PET 大载体组成，而在 scale-X 生物反应器中，固定床类似于双层卷状结构，PET 膜层之间有一个间隔网。scale-X 生物反应器系列中只有一种压实度。在我们的研究中，我们发现慢病毒和腺病毒载体在iCELLis Nano 和 scale-X Hydro 生物反应器中的生产力相等，而与 iCELLis Nano相比，细胞在 scale-X Hydro 中的分布更好。目前，Scale-X 生物反应器至少已用于疫苗生产。
固定床生物反应器中的最新发明是Corning的 Ascent™ 生物反应器，它包含编织的PET 膜，在其中，细胞应该比其它固定床生物反应器更均匀地分布。在Ascent 生物反应器中，细胞以 2D 方式培养并且可以酶促分离。此外，生物反应器使用不同的、剪切力较小的策略为细胞提供氧气和营养物质。与scale-X 类似，在 Ascent 生物反应器系列中，有或计划提供从研发水平（1-5 m2）到中等规模（20-100 m2）再到商业化规模（1000m2）的生物反应。
使用悬浮细胞进行慢病毒生产
尽管使用贴壁生物反应器，可以将生产规模放大到500-1000 m2的培养面积，并且通过优化方案可以生产大量慢病毒，对于某些需要在体内治疗的疾病，贴壁培养的规模可能还不够。从长远来看，在悬浮生物反应器中进行病毒载体的生产很可能是最具成本效益的选择，因为理论上可放大性是无限的，但可能需要对大规模的转染操作进行优化。慢病毒已可成功地在悬浮培养中生产。现在，已经有悬浮生物反应器能够进行培养，从非常适合作为规模缩小模型的、非常小的生物反应器到培养体积超过 1千升的、非常大的搅拌罐（表 1）。悬浮生物反应器有波浪混合式和搅拌罐式生物反应器选择。此外，还提供重复使用和一次性使用选择。对于工艺优化，悬浮培养中的选择可以被认为比贴壁工艺更好，例如Ambr® 15 和 Ambr 250 生物反应器 (Sartorius)，最多可以运行24 (Ambr 250) 或 48 (Ambr 15))个并行生物反应器，培养体积分别在10–15 mL (Ambr 15) 和100–250 mL (Ambr 250) 之间。在贴壁生物反应器中，仍然缺少类似的、非常小规模的多模块系统。
悬浮培养不需要FBS，市面上有很多悬浮培养基，如Freestyle™ (Gibco)、HyClone™ SFMTransfx-293 (Cytiva)、BalanCD (Irvine Scientific)和Ex-CELL® CD HEK293病毒载体培养基(Merck)，其经化学限定，不含动物源性化合物，可减少产品中有害污染物的数量。但是，如果生产系统最初是贴壁的，则转移到悬浮工艺可能具有挑战性。并非所有细胞都容易在悬浮培养中生长良好并生产病毒，优化可能很费力，转移也可能会失败。将该工艺转移到悬浮非常困难的一个原因可能是FBS 不用于悬浮生产，而其至少有利于逆转录病毒载体的生产。
如何获得足够的细胞进行接种？
当前的生物反应器已经能够将培养体积扩大到数百甚至数千升。然而，当工艺放大时，还需要考虑其它方面。对于小规模生物反应器，很容易扩增细胞以进行接种，例如使用 T型烧瓶或摇瓶。然而，在大规模生产中，需要大量的细胞。在悬浮工艺中，可以使用比实际生产操作更小规模的悬浮生物反应器来扩增细胞。然而，对于贴壁工艺，用于接种的细胞扩增可能更加棘手。一种选择是使用2D 培养系统，例如 Hyperflasks，但对于非常大的数量，这是非常费力的选择。如果生产细胞可以悬浮和贴壁生长，则可以在接种大规模贴壁生物反应器之前使用中等规模悬浮生物反应器来扩增细胞。目前也有一些可用作N-1 生物反应器的贴壁生物反应器，用于扩增细胞以接种更大的生物反应器，例如Pall 的 Xpansion®。此外，由于细胞可以从Corning的Ascent 生物反应器中分离出来，因此不仅可以将其用于病毒生产，还可以用于扩增细胞，以用于更大的生物反应器。
大规模转染：慢病毒生产中最关键的一步
瞬时转染的成功直接影响产量。转染是慢病毒工艺过程中最昂贵的步骤之一，因为在商业化规模生产中需要大量高质量的质粒和转染试剂。由于CaPO4 共沉淀法不是最适合大规模转染的方法，因此在规模放大时需要考虑其它转染策略。电转是小规模和中等规模悬浮培养的不错选择，但可能不是非常大规模转染的最佳选择。FlowElectroporation™ 技术(MaxCyte®) 也适用于大量细胞，但不适用于贴壁培养。与CaPO4 相比，PEIpro®（PolyPlus transfection）等聚乙烯亚胺 (PEI) 是一种相对便宜、毒性更低的试剂，它不仅适用于贴壁培养，而且适用于悬浮培养。此外，PEIpro提供研究级产品，但具有同样的高质量和GMP级别。我们已经证明可以减少质粒数量（从而降低成本），优化小规模贴壁生物反应器中PEI 介导的转染方案，并在不降低单位面积生产力的情况下将该工艺放大到商业化规模。除了PEIpro，还有其它转染试剂，例如Lipofectamine™ (Thermo Fisher) 和TransIT-VirusGEN® (Mirusbio)，与PEI 相比，后者已被证明可获得更高的滴度，尤其是在悬浮培养中，其也可提供GMP 级产品。然而，与 PEI 相比，这两种试剂都更昂贵。
优化转染时应考虑的一个重要方面是转染方案在大规模条件下的工作情况。如何以尽可能相似的方法进行混合、孵育以及将转染混合物添加到生物反应器中，以便在规模放大后也具有相同大小的转染复合物？商业化规模需要大量质粒，因此，需要考虑的一个重要因素是在孵育过程中转染混合物的DNA 浓度，因为转染试剂对此可能有最大限制。此外，对于工作体积通常低于70 L 的贴壁生物反应器，转染混合物通常保持在合理的体积范围内。然而，对于>1000 L 的悬浮生物反应器，转染混合物的制备可能更具挑战性。
由于瞬时转染成本高昂，并且残留的质粒会在最终产品中造成免疫反应的风险，因此在最理想情况下，是使用稳定生产细胞系生产慢病毒。消除转染步骤可以减少批次间的差异，因为转染引起的差异被排除在外。尽管已经做了大量的开发工作，但稳定包装细胞系仍然存在不少相关的问题。由于VSVg、gag 和 pol 等毒性慢病毒基因的延长表达，组成型包装细胞系通常生产滴度较低。然而，用无毒囊膜蛋白假型化的慢病毒已经获得了良好的经验。对于VSVg 假型慢病毒，一种选择是使用可诱导系统，但这些系统要么有泄漏，要么生产率很低。大规模的Tet-off 型系统既费力又耗时，因为诱导通常需要多个完整的培养基置换/漂洗步骤。尽管 Tet-on 型系统泄漏较少，并且由于将诱导剂添加到培养中而不完全去除，因此更容易诱导病毒产生，但在下游工艺中通常需要更多的纯化步骤，因为需要去除诱导剂。
培养策略和收获
在选择培养策略时，无论是使用批次还是更连续的策略，重要的是要考虑如何收获半衰期较短的慢病毒产品，以及该策略对产量和收获体积的影响，因此还要考虑下游工艺。批次模式可能不是最佳的。细胞通常需要新鲜培养基才能保持更好的状态，达到转染的最佳细胞密度并更长时间地产生病毒。批次策略的优点是方法简单且相当便宜，收获体积相对较低。但是，如果使用其它策略，产量可能会更大。
比批次模式更进一步的选择，是通过排空培养基并重新补充生物反应器，来分多个步骤进行收获。虽然通过这种方式，收获体积和可能的产量会更大，但该策略本身非常耗时且费力。它可以在贴壁工艺中进行，但在悬浮生物反应器中，这种策略，特别是在大规模时，非常复杂。
为了提高细胞密度、补液细胞和增加病毒产量，通常会应用灌流或再循环。在贴壁固定床生物反应器中，由于细胞保持附着在培养表面，因此灌流/再循环很简单。通过优化灌流 - 例如，通过像我们所做的那样，以低葡萄糖浓度为目标 -可以减少培养基消耗，从而降低成本，并最大限度地减少收获体积而不影响总产量。
灌流也可应用于悬浮培养，但由于细胞不附着在任何表面而是自由漂浮在培养基中，因此需要将细胞和培养基彼此分离。对于一些中等规模的波浪使悬浮生物反应器，可以使用基于膜的灌流选项（例如Sartorius Biostat RM 系统）。然而，对于更大规模，需要其它灌流系统。交替式切向流(ATF)，即Repligen 的 XCell ATF®系统，通常与悬浮生物反应器一起用于重组蛋白的生产。该系列系统提供重复使用和一次性使用选项，并且具有不同的尺寸，从适用于0.5-2 L 反应器的 ATF1 到可与高达 1000 L 的生物反应器一起使用的ATF10，此外，也可将两个 ATF10 系统并联用于高达2000 L的悬浮生物反应器。然而，ATF对于脆弱的慢病毒可能过于“苛刻”，因此应仔细设计所使用的方案。切向流深层过滤（TFDF®，亦为 Repligen 产品；可在1-2000 L 之间规模缩放）已用于分离慢病毒悬浮工艺中的细胞，并且可能也可用于灌流。此外，声波系统已被用于慢病毒和其它载体的悬浮生产，但尚未大规模使用。固定床生物反应器也可用于悬浮工艺，此时，悬浮细胞不附着到固定床，而是被困在其中，这允许应用与固定床生物反应器中的贴壁培养相同的灌流系统。它还可使澄清步骤更容易，因为在进一步的下游工艺之前，不需要将大量细胞从培养基中分离出来，就像在传统的悬浮工艺中那样。
在商业化规模生产中，收获体积很容易增加到数百甚至数千升。考虑到收获后产物需要进行下游工艺，收获非常稀释的病毒是不明智的，比如太早开始收获或者在滴度已经下降太多的情况下继续收获太久，因为这样可以增加收获体积，从而增加成本和劳动力。在我们的贴壁工艺中，我们在转染后24 小时和转染后 72 小时之间收获灌流培养基，在开始收获后，用于灌流的培养基不含 FBS，因为这样可以减少残留 FBS 的量，使该工艺更便宜，更重要的是，利于下游工艺。然而，由于慢病毒的半衰期短，连续工艺可能是理想的选择，其中，病毒被收获并立即进行下游处理，而不将这两个步骤作为单独的步骤执行。
原文：H.Leinonen, Commercial-scale lentiviral vector manufacturing: is the myth busted? Cell & Gene Therapy Insights 2022; 8(1), 3–13.
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